出现非特异性扩增带
pcr扩增后出现的条带与预计的大小不致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：是引物与靶序列不*互补、 或引物聚合形成聚体。是mg2+离子浓度过、退火温度过低，及pcr循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往些来源的酶易出现非特异条带而另来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提退火温度或采用温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
pcr扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dntp浓度过，mg2+浓度过，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另来源的酶。②减少dntp的浓度。适当降低mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
克隆pcr产物1)克隆pcr产物的条件是什么？
摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2x连接液, 50ng质粒dna,1weiss单位的t4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺t-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提连接效率，需4℃过夜。
2)pcr产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的聚体。少量的引物聚体的摩尔数也很，这会产生比例的带有引物聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
a）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
b）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用soc稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板dna的总量。
铺板dna的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng dna，用soc稀释到1000u后含10 ng dna，用1/10铺板，共用1 ng dna。转化率为：
1000克隆x10（3次方） ng /铺板1 ng dna ug=10（6次方）cfu/ ug
转化pgem-t应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
c）如用pgem-t正对照，或pcr产物，产生>20-40蓝斑（用步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去t。可能是连接酶污染了核酸酶。t4 dna连接酶（m1801，m1804，m1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的t4 dna连接酶替换。
d）用pgem-t或pgem-t easy载体，连接pgem-t正对照，转化频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
a）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提效率，需4℃过夜。
b）插入片段带有污染，使3`-t缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pgem-t正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pgem-t或pgem-t easy载体3`-t缺失。
c）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受uv过度照射，时有发生。uv过度照射会产生嘧啶聚体，不利于连接，dna必需重新纯化。
d）带有修复功能的耐热dna聚合酶的扩增产物末端无a，后者是pgem-t或pgem-t easy载体克隆所需。加taq dna聚合酶和核苷酸可在末端加a。详情查pgem-t pgem-t easy载体技术资料（tm042）。
e）度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如sure细胞
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